Projekt EGZODOG

Omika pristup i dubinska fenotipizacija u otkrivanju novih biomarkera iz egzosoma u bolestima srca pasa (EGZODOG)

Sažetak projekta

Degenerativna bolest mitralnih zalistaka (MMVD) najčešća je stečena srčana bolest u pasa i vodeći uzrok kardiovaskularnog morbiditeta i mortaliteta. Dijagnoza se temelji na kliničkim simptomima i slikovnoj dijagnostici, no prepoznavanje bolesti u asimptomatskoj fazi ostaje izazov. Stoga je identificiranje ranih dijagnostičkih biomarkera od ključne važnosti. Razvoj molekularne kardiologije pokazao je da egzosomi mogu poslužiti kao potencijalni biomarkeri u kardiovaskularnim bolestima. Egzosomi, mali vezikuli uključeni u međustaničnu komunikaciju, prenose biološki aktivne molekule (proteine, lipide, metabolite, nukleinske kiseline) i odražavaju fiziološka i patološka stanja. Razvoj tehnika koje se temelje na spektrometriji mase, u proteomici i metabolomici, otvorio je nove mogućnosti u otkrivanju novih biomarkera egzosoma u bolestima srca pasa. Cilj našeg projekta je istražiti molekularni sastav egzosoma izoliranih iz urina pasa s različitim stadijima MMVD i zdravih pasa, s ciljem otkrivanja novih biomarkera. Analizom proteoma i metaboloma egzosoma želimo identificirati rane i razlikovne biomarkere, istražiti interakcije između molekula te unaprijediti dijagnostiku MMVD. Očekivani rezultati mogu pridonijeti ranijoj dijagnozi i boljem ishodu liječenja pasa oboljelih od ove bolesti.

Ciljevi projekta

  1. Prikupiti uzorke urina pasa s dijagnosticiranim različitim (B1, B2 i C) stadijima razvoja degenerativne bolesti mitralnih zalistaka (MMVD) i u klinički zdravih pasa
  2. Izolirati i karakterizirati cirkulirajuće egzosome izdvojene iz uzoraka urina pasa s MMVD (stadij B1, B2 i C) i klinički zdravih pasa                                                                                                                 
  3. Usporediti proteome cirkulirajućih egzosoma dobivenih iz urina pasa s MMVD-om (stadij B1, B2 i C) u odnosu na klinički zdrave pse                                                                                                           
  4. Definirati temeljni proteom egzosoma iz urina pasa s različitim stadijima MMVD i procijeniti ga kao potencijalni izvor biomarkera važnih za ranu dijagnostiku MMVD (stadij B1)                                       
  5. Validirati proteomske rezultate dobivene spektrometrijom masa s ELISA-om i Western blot pristupom                                                                                                                              
  6. Usporediti metabolome neciljanog/ciljanog metaboličkog profiliranja cirkulirajućih egzosoma iz urina pasa s MMVD (stadij B1, B2 i C) u odnosu na klinički zdrave pse           
  7. Definirati temeljni metabolom neciljanog/ciljanog metabolomskog profiliranja cirkulirajućih egzosoma iz urina pasa s različitim stadijima MMVD i procijenti ga kao potencijalni izvor biomarkera važnih za ranu dijagnozu MMVD (stadij B1)                         
  8. Identificirati najvažnije proteomske i metabolomske značajke cirkulirajućih egzosoma  izoliranih iz urina pasa s MMVD primjenom integriranog omika pristupa (proteomika i metabbolomika)               
  9. Otkriti nove proteomske i metabolomske biomarkere cirkulirajućim egzosoma za ranu dijagnostiku (stadij B1), stratifikaciju (stadij B1, B2 i C) i praćenje MMVD-a kod pasa, koristeći integrirane omika rezultate                                                                                                                                   
  10. Dobiti dublji uvid u molekularne promjene koje se događaju tijekom razvoja MMVD u pasa, analiziranjem  patofizioloških (bioloških) procesa na razini proteina i metabolita upotrebom integriranih omika rezultata.                                                                                                         
  11. Identificirati molekularne signalne putove koji su uključeni u razvoj MMVD u pasa s naglaskom na B1 stadij MMVD                                                                                                                                   
  12. Objaviti tri rada u časopisima iz prve kvartile (Q1) prema WoS-u ili Scopusu s visokim čimbenikom odjeka

Opis projekta

  1. trenutno stanje u području istraživanja                                                                                     

    Kardiovaskularne bolesti jedan su od vodećih uzroka smrti kod ljudi, a glavni uzrok smrti kod pasa (Brugada-Terradellas i sur., 2021). Srce kod pasa i ljudi dijeli mnoge karakteristike na razini organa i stanica. U veterinarskoj medicini, degenerativna bolest mitralnih zalistaka  (MMVD) najčešća je prirođena srčana bolest i jedan od glavnih uzroka morbiditeta lijeve strane srca, zatajenja srca (CHF) i smrtnosti povezane sa srcem kod pasa. S pojavom CHF-a mediano vrijeme preživljavanja pasa je od 1 do 9 mjeseci. MMVD je najčešći uzrok CHF-a kod pasa, odgovarajući za otprilike 75 % svih srčanih bolesti (Atkins i sur., 2009). Koriste se različiti nazivi za MMVD kod pasa, uključujući endokardiozu, valvularnu regurgitaciju, valvularnu insuficijenciju, mitralnu regurgitaciju. Malo se zna sa sigurnošću o osnovnoj etiologiji i patogenezi progresivnih promjena na srčanom zalisku kod MMVD u pasa. Istraživanja sugeriraju da bolest ima poligeni multifaktorski nasljedni obrazac (Olsen i sur., 1999), što je posebno vidljivo kod tzv. čistokrvnih pasmina, poput visoko osjetljivih pasmina kavalirskog kraljevskog španijela i jazavčara. Bolest je kronična i progresivna, a početni znakovi obično se manifestiraju kao srčani šum. Radi se o sporo progresivnom stanju koje utječe na anatomiju i funkciju srčanog zaliska kod pasa srednje do starije dobi. Slučajevi brže progresije viđeni su kod čistokrvnih pasa. Glavne značajke uključuju aktivaciju i transformaciju intersticijskih stanica mitralnih valvula u aktivni fenotip, što dovodi do promjena u izvanstaničnom matriksu i posljedično do narušavanja strukturalnih komponenti mitralnog zaliska (Oyama i sur., 2020). Pretpostavlja se da oštećenje ili gubitak endotela igra važnu ulogu u progresiji bolesti jer je poznato da endotelne stanice opsežno komuniciraju sa subendotelnim stanicama. MMVD najčešće dovodi do lezija mitralnog zaliska, a ponekad oba atrioventrikularna zaliska. Kod pasa i ljudi, MMVD je karakteriziran poremećajem histoloških slojeva mitralnog zaliska, što može rezultirati zadebljanjem, nabiranjem, prolapsom i oštećenjem zaliska te izduženjem i pucanjem tetiva (Fox, 2012). Napredak ovih promjena može dovesti do progresivne degenerativne bolesti mitralnih zalistaka, što rezultira regurgitacijom mitralnog zaliska. Komplikacije u kasnijim fazama bolesti uključuju razvoj zatajenja srca, poremećaje ritma i konačnu smrt pacijenata. Psi često razvijaju srčani šum, ali mogu ostati asimptomatski tijekom nekoliko godina. Trenutno, najčešća skupina viđena u kliničkoj praksi obuhvaća pse u stadiju C, kroničnog MMVD-a. Dijagnoza pasa u ranim asimptomatskim fazama (B1 i B2) obično se postavlja tijekom redovnih, preventivnih pregleda, što se događa rijetko. Međutim, glavni izazov u kliničkoj procjeni asimptomatskih pasa leži u pravovremenom prepoznavanju prijelaza iz stadija B1 u stadij B2 kod MMVD-a. Unapređenje kliničke procjene stadija B moglo bi olakšati pravovremeno započinjanje liječenja, posebno s obzirom na ograničenu dostupnost i visoke troškove kirurškog popravka zaliska kod pasa. U idealnom slučaju, učinkovito i pravovremeno upravljanje MMVD-om odgodilo bi ili značajno usporilo progresiju bolesti u simptomatsku fazu (stadije C i D).

    Trenutno se dijagnoza MMVD-a kod pasa temelji prvenstveno na kliničkim simptomima i slikovnim pretragama. Međutim, bez kliničkih simptoma (stadiji B1 i B2) teško je prepoznati razvoj bolesti kod pasa. Osim navedenog, ehokardiografija i radiografija (zlatni dijagnostički standardi) te veterinarski kardiolozi, prvenstveno se nalaze u većim klinikama. Pored navedenog, dijagnostika temeljena na slikovnim pregledima relativno je dugotrajna i skupa, a u slučaju ehokardiografije možda nije dostupna svim pacijentima. Parametri tradicionalnih laboratorijskih testova (npr. biokemijski, hematološki i koagulacijski testovi, analiza urina i izmeta) mogu biti izmijenjeni tijekom kliničkog pregleda, ali ti parametri nisu specifični za srčane bolesti. Specifični proteini i metaboliti otkrivaju se kao biomarkeri radi poboljšanja dijagnostike, prognoze i ishoda liječenja bolesti. Oni su posebno relevantni u ljudskom i veterinarskom istraživanju zbog njihove važne uloge u karakterizaciji bolesti. Biomarkeri imaju potencijal identificirati ključne pokazatelje bolesti u ranim fazama prije razvoja kliničkih znakova, sprječavajući da bolest postane ozbiljna. Moderna ljudska kardiologija uvelike se oslanja na relativno malen broj biokemijskih, cirkulirajućih markera za dijagnostiku i prognozu, od kojih su najistaknutiji troponin-I (cTnI) i natriuretski peptid (NT-ProBNP), iako se koriste i drugi nespecifični biomarkeri poput C-reaktivnog proteina (CRP), kreatinfosfokinaze, prokalcitonina. Nažalost, svi ti cirkulirajući biomarkeri imaju ograničenu dijagnostičku vrijednost u asimptomatskoj fazi MMVD-a (stadiji B1 i B2). Stoga, važnost definiranja ranih dijagnostičkih biomarkera koji mogu pomoći u otkrivanju i možda sprečavanju progresije MMVD-a kod kućnih ljubimaca zbog visoke učestalosti MMVD-a i zatajenja srca u pasa, kao i nedostatka odgovarajućeg medicinskog tretmana u stadijima C i D je izuzetno važna. Cirkulirajući biomarkeri mogu biti ključni za razumijevanje mehanizama razvoja MMVD-a.

    Omiks tehnologije, posebice proteomika i metabolomika, snažni su analitički alati za otkrivanje i validaciju biomarkera, budući da identificiraju male varijacije u obilju proteina ili metabolita bez prethodno odabranih molekularnih ciljeva. Danas, zbog svog velikog potencijala za procjenu biomarkera, proteomika i metabolomika su najčešće primijenjeni pristupi u području biologije sustava.

    Dijagnostika kardiovaskularnih bolesti temeljena na biomarkerima prelazi s korištenja pojedinačnih biomarkera na proteomske i metabolomske pristupe, što omogućuje precizno identificiranje i kvantificiranje stotina do tisuća malih molekula proteina i metabolita u biološkim uzorcima. Brojna istraživanja u humanoj medicini usmjerena su na traženje proteina i metabolita kao biomarkera za temeljne kardiovaskularne bolesti.  No, u veterinarskoj kardiologiji, tzv. “omika” pristupi još su u povoju. Istraživanje provedeno na psima s MMVD-om pokazalo je da približno 50 % pasa ima višu koncentraciju serotonina (5HT) u serumu u usporedbi s kontrolnim psima (Arndt i sur., 2009). Dodatno, nekoliko studija procijenilo je metaboličke profile kod pasa s MMVD-om. U studiji Zhou i sur. (2023), autori su analizirali promjene u proteomu izvanstaničnog matriksa (ECM) u plazmi pasa s MMVD-om. Od 16 proteina povezanih s ECM-om, autori su identificirali SERPINH1 kao potencijalni dijagnostički biomarker za MMVD u stadiju B2. U drugoj studiji (Li i sur., 2015), istraživači su usporedili serumski metabolom pasa s MMVD-om s kontrolnom grupom i otkrili da je 41 metabolit značajno različit između skupina, što sugerira promjene u energetskom metabolizmu i oksidativnom stresu. Međutim, postoji nedostatak sistemskih studija koje uspoređuju proteomski i metabolomski profil asimptomatskih B1 i B2 stadija (Saril i sur., 2022).

    Poboljšanja u strategiji istraživanja bolesti srca, kao i u tehnologiji, dovela su do novih pristupa u dijagnostici bolesti srca. Molekularna kardiologija brzo napreduje, uključujući potencijal izvanstaničnih vezikula (EVs), odnosno egzosoma i njihovog molekularnog ,,tereta”, poput proteina, metabolita, lipida, DNA i RNA. Zadnjih godina egzosomi zauzimaju značajno mjesto u istraživanju kardioloških bolesti  (Lai i sur., 2023). Naime, egzosomi su EV s rasponom veličina od 40 do 160 nm (prosječno ~100 nm) u promjeru s endosomskim podrijetlom. Stvaraju ih sve stanice i nose nukleinske kiseline, proteine, lipide i metabolite. Oni su posrednici međustanične komunikacije na blizinu i daljinu, u zdravlju i bolesti te utječu na različite aspekte stanične biologije. Obavijeni su lipidnom ovojnicom, a oslobađaju se iz stanica kako u fiziološkim tako i u patološkim uvjetima. Imaju ključnu ulogu kao bioaktivni posrednici u međustaničnoj komunikaciji (međustanični komunikatori) prenoseći biološki aktivne molekule kao što su proteini, lipidi, metaboliti ili nukleinske kiseline koji su uključeni u specifične odgovore (Valadi et al., 2007). Oni predstavljaju neinvazivne  dijagnostičke biomarkere  i terapijske nanonosače. Pored njihove biološke uloge u staničnoj komunikaciji, EVs, odnosno egzosomi smatraju se novim alatima u ranoj dijagnostici bolesti. U srcu i krvnim žilama, stanice, kao što su kardiomiociti, endotelijalne stanice, glatko mišičje krvnih žila, srčani fibroblasti, upalne stanice i rezidentne matične stanice, uključeni su u homeostazu srca preko oslobađanja egzosoma. Egzosome možemo ih naći u svim tjelesnim tekućinama (npr. krv, urin, slina, mlijeko, cerebrospinalna tekućina), a pri tome mogu prijeći višestruke biološke barijere. Molekularni sastav i fizičke karakteristike egzosoma mijenjaju se ovisno o fiziološkom i patofiziološkom stanju izvornih stanica.

    Istraživanje egzosoma privuklo je značajnu pažnju u veterinarskoj medicini zbog njihovih potencijalnih dijagnostičkih i terapijskih primjena (Moccia et al., 2022). Procjena proteomskog i metabolomskog profila tereta egzosoma od velike je važnosti. Sastav ovog bioaktivnog tereta podložan je varijacijama i visoko je dinamičan, ovisno o podrijetlu egzosoma, fiziološkom stanju i okolini (Moccia et al. 2022). Egzosomi imaju značajnu ulogu u kardiovaskularnim bolestima, odnosno aterosklerozi, apoptozi, hipertrofiji, angiogenezi, fibrozi srca, infarktu miokarda (Reiss i sur., 2023). Proteini i metaboliti iz egzosoma imaju potencijal kao mogući biomarkeri u različitim bolestima, uključujući bolesti kardiovaskularnog sustava (Lawson et al., 2016). Njihov broj, molekularni sadržaj i podrijetlo mogu pružiti korisne informacije o patofiziologiji kardiovaskularnih poremećaja (Dickhout and Koenen, 2018).  Budući da se egzosomi formiraju pod uvjetima stresa ili ozljede, cirkulirajući egzosomi kod pacijenata postali su zanimljiv izvor biomarkera za bolesti srca. Nadalje, poboljšanje analitičkih tehnika na temelju spektrometrije masa omogućuje karakterizaciju sastava proteina i metabolita egzosoma kako bi se bolje razumjela njihova uloga u bolestima (Mallia et al., 2020). Pri tome egzosomi iz urina imaju naročitu važnost. Naime, izolati egzosoma u urinu omogućuju detekciju molekula koje prethodno nisu bile identificirane u urinu zbog njihove niske koncentracije u urinu ili zbog njihovog položaja unutar egzosoma. Različita istraživanja pokazala su da EV-i doprinose normalnoj fiziologiji, uključujući razvoj kardiovaskularnih bolesti (Wang i sur., 2017). Egzosomi su postali ključni posrednici srčanog popravka nakon oštećenja, pomažući u smanjenju apoptoze, rješavanju upale i formiranju novih krvnih žila. Stoga Badila i suradnici (2023) predlažu da istraživanje biomarkera EVs može otkriti mehanizme specifične za bolest, kao i rani stadij oštećenja srca i razjasniti nove terapijske pristupe. Također, dokazano je da kardiomiociti oslobađaju EV-e koji sadrže proteinske biomarkere rane srčane ozljede, prije troponina srčanog mišića (Yarana i sur., 2017).                                                                                                               

  2. sažeti pregled vlastitih istraživanja povezanih s temom projekta                                               

    Naša proteomska istraživanja u serumu pasa s MMVD-om pružila su djelomično novi pogled na dijagnostiku bolesti s ranim biomarkerima. U prvom istraživanju MMVD-a koristeći kvantitativni proteomski pristup temeljen na tandemskoj spektrometriji masa peptida označenih TMT metodom, identificirali smo i kvantificirali 290 proteina seruma, od kojih je 15 proteina imalo značajno različitu ekspresiju. To su bili proteini komplementarnih i koagulacijskih kaskada, hemostaze, regulacije citoskeletnog aktina, metabolizma lipida i transporta (Kuleš i sr., 2020). Naše najnovije istraživanje MMVD-a u serumu pasa, koristeći isti analitički pristup kao i u prvom istraživanju, otkrilo je pet potencijalnih proteinskih biomarkera koji bi mogli pružiti jasniju razliku između stadija B1 i B2 MMVD-a (Rešetar Maslov i sur., 2023). Naše proteomsko istraživanje na egzosomima iz mlijeka krmača u različitim fazama laktacije otkrilo je različite profile proteina kolostruma i mlijeka (Furioso Ferreira i sur., 2021). Naša kasnija istraživanja potvrdila su da različiti omjeri omega-6 prema omega-3 masnim kiselinama u prehrani krmača utječu na proteom egzosoma izoliranih iz mlijeka krmača (Furioso Ferreira i sur., 2022). Naša istraživanja o serumskim EVs u infektivnim bolestima uzrokovanim Theileria spp. kod bivola, pružila su dodatni uvid u odnos domaćin-parazit, pridonoseći boljem razumijevanju mehanizama izbjegavanja parazita (de Pontes i sur., 2020). Naše nedavno preliminarno istraživanje uključivalo je karakterizaciju i analizu EVs izoliranih iz seruma pasa prirodno zaraženih s Babesia canis. Identificirali smo 211 Canis lupus proteina, od kojih je 147 proteina potvrđeno kao proteini EV-a. EV izolirane iz seruma pasa zaraženih s B. canis bili su Cd9+, Cd63+, Cd81+, i Cd82+. Nadalje, za 73 Canis lupus proteina potvrđeno je da su povezani s EVs i specifični za EVs izolirane iz seruma pasa inficirane s B. canis. To su uglavnom bili membranski i citosolni proteine, povezani sa stečenim i prilagođenim imunološkim sustavima, posebno onima uključenima u adheziju i mehanizme proteoglikana, poput integrina (Rešetar Maslov i sur. 2024). Naše najnovije istraživanje o neciljanoj lipidomici izvanstaničnih vezikula otkrilo je jedinstvene lipidne potpise EVs kolostruma i mlijeka krmača (Furioso Ferreira i sur., 2025). Analiza proteomskog i metabolomskog sadržaja u egzosomima izoliranim iz urina pasa s MMVD-om dosad nije istražena.                           

  3. istraživački plan koji uključuje detaljan opis metodologije                                                         

    Ovo istraživanje dizajnirano je s fokusom na identificiranje ranih biomarkera za dijagnostiku MMVD iz egzosoma urina i zdravih kontrola primjenom proteomike i metabolomike.                       

     

Metodologija

Projekt je strukturiran u nekoliko radnih paketa:

Prvi radni paket (prva i pola druge godine trajanja projekta) Voditelj: Vladimir Mrljak

Dijagnostika degenerativna bolest mitralnih zalistaka, uzorkovanje urina, izolacija i karakterizacija egzosoma iz urina.  Prvi radni paket obuhvaća sakupljanje uzoraka urina pasa kod kojih je dijagnostičkim postupkom dokazana degenerativna bolest mitralnih zalistaka  (MMVD), i to asimptomatska skupina pasa (B1 i B2), odnosno simptomatska skupina pasa (skupina C). Svim psima s potvrđenom dijagnozom MMVD biti će u okviru dijagnostičkog postupka uzet urin i krv. Ostatni uzorci urina i krvi (serum) biti će korišteni u daljnjim laboratorijskim istraživanjima. Istovremeno, psima za koje se utvrdi da su temeljem laboratorijskih nalaza zdravi, a došli su na postupak kastracije u ambulante Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Mursiji, Španjolska biti će uzet urin, alikvotiran i deponiran na -80°C, te upućen u Laboratorij za proteomiku VEFUNIZG. U okviru prvog radnog paketa provest će se izolacija egzosoma metodom ultracentrifugiranja, te karakterizacija egzosoma putem analize praćenja čestica (NTA), transmisijskog elektronskog mikroskopa (TEM) i Western blot analize.

Klinička dijagnoza, rutinska laboratorijska analiza krvi i urina. Studija će obuhvatiti dvije glavne skupine pasa. Skupina 1 sastoji se od pasa dijagnosticiranih s miksomatoznom mitralnom valvularnom bolešću (MMVD) (n = 90), različitih pasmina, dobi i tjelesnih masa dijagnosticiranih u Sveučilišnoj veterinarskoj bolnici Veterinarskog fakultetu Sveučilišta u Zagrebu. Svake godine Sveučilišna veterinarska bolnica ima više od 220 pacijenata s MMVD-om. Od toga je 96 pacijenata u stadijima B1 i B2, a ostali su u stadijima C i D. Ovi psi će proći sveobuhvatan fizički i transtorakalni ehokardiografski pregled (TTE), zajedno s uzimanjem uzoraka krvi i urina za laboratorijske analize. Dodatno, psi sa sumnjom na aritmiju ili koji pokazuju aritmiju tijekom pregleda proći će dvanaest-kanalni elektrokardiogram (ECG). Psi će biti snimljeni iz desne i lijeve parasternalne pozicije, pri čemu će se standardne dvodimenzionalne, M-mode i Doppler ehokardiografske slike dobiti bez sedacije, slijedeći uspostavljene standarde transtorakalne ehokardiografije (Thomas i sur., 1993). Psi u Skupini 1 bit će klasificirani u tri podskupine na temelju medicinske povijesti, kliničkih simptoma, fizičkog pregleda i rezultata ehokardiografije, sukladno smjernicama Američkog koledža unutarnje veterinarske medicine (ACVIM) za dijagnozu i liječenje MMVD-a (Keene i sur., 2019). Podskupine uključuju pse u fazi B1 MMVD-a (n=30) (podskupina 1.1.), pse u fazi B2 MMVD-a (n=30) (podskupina 1.2.) i pse u fazi C  MMVD-a (n=30) (podskupina 1.3.). ACVIM sustav klasifikacije definira preuređenje srca koristeći omjer lijevog atrija prema aorti (LA/Ao) i normaliziranu dijastoličku veličinu lijeve klijetke prema tjelesnoj težini (LVIDdN) kako bi se razlikovali psi u fazama B1 i B2. Psi u fazi C pokazuju tešku kliničku sliku zatajenja srca (bilo trenutno ili u prošlosti), dok su psi u fazi D oni s trenutnim ili prošlim zatajenjem srca na koje standardni protokoli liječenja ne djeluju (Keene et al., 2019.). Skupina 2 obuhvaća 30 zdravih pasa. Urin i krv zdravih pasa koji su došli na kastracije na Veterinarski fakultet Sveučilišta u Mursiji, Španjolska biti će uzet u ambulantama tijekom operativnog postupka, provjereni laboratorijski podaci, a urin alikvotiran i spremljen na -80°C, te dostavljen u Laboratorij za proteomiku VEFUNIZG.  Kalkulator veličine uzorka – Za izračun veličine uzorka za ovu studiju upotrijebili smo pristup temeljen na literaturi (Ruxton i Colegrave, 2016). Konkretno, iz prethodno objavljene proteomske studije u pasa s kroničnom bolešću zalistaka (CVD) (Rešetar Maslov i sur., 2023.) relativna zastupljenost proteina između skupina analizirana je pomoću Kalkulatora veličine uzorka (https://clincalc.com/stats/samplesize.aspx). Uzimajući u obzir željenu statističku snagu od 80%, što je uobičajena razina u biokemijskim istraživanjima i razinu značajnosti od p<0,05 kao vjerojatnost statističke pogreške tipa I, procijenjena veličina uzorka je 29 po skupini (prosjek na temelju svih značajno različitih proteina u studiji).

Priprema uzoraka urina za izolaciju i karakterizaciju egzosoma, te proteomsku i metabolomsku analizu molekularnog tereta (proteom/metabolom) egzosoma.                                                                             

Psi s MMVD (Skupina 1). Uzorci krvi za hematološku i biokemijsku analizu, odnosno analizu urina, prikupit će se u okviru redovitog dijagnostičkog postupka u kardiološkoj ambulanti Sveučilišne veterinarske bolnice VEFUNIZG. Ostatni urin iz dijagnostičkog postupka prikupit će se za izolaciju i karakterizaciju egzosoma te za proteomsku i metabolomsku analizu molekularnog tereta egzosoma. Urin će biti uzet punkcijom mokraćnog mjehura (Cystocentesis) pod kontrolom ultrazvuka u sterilnu posudu za uzorkovanje urina. Minimalni volumen urina za izvođenje proteomskih i metabolomskih istraživanja je 9 ml (Musante i sur., 2020). Uzorak urina od 10 ml biti će centrifugiran na 1000 x g tijekom 10 minuta na 4°C da bi se uklonile stanice krvi iz urina. Supernatant će biti alikvotiran u sterilne Eppendorf tubice i centrifugiran na 16.000 x g tijekom 10 minuta na 4°C da bi se odvojio stanični ostaci (,,debri”). Pročišćeni urin biti će ponovo alikvotiran u sterilne Eppendorf tubice u koje su prije toga dodani inhibitori proteaza (cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail, Roche) te deponirani na -80°C do nastavka istraživanja. Rutinska analiza urina provodit će se pomoću analizatora urina Bayer Clinitek Status (Bayer/Siemens Advia, Njemačka). Vlasnici će biti obaviješteni da dovedu svog psa na uzimanje krvi nakon 12-satnog gladovanja i bez prethodne tjelesne aktivnosti. Time bi se izbjegao utjecaj unosa hrane i tjelovježbe na razinu egzosoma u cirkulaciji i regulaciju proteinskog tereta u egzosomima. Vrijeme prikupljanja bioloških uzoraka temeljit će se na dostupnosti pacijenta, ali svi će uzorci urina i krvi biti prikupljeni između 9 i 14 sati kako bi se izbjegao utjecaj cirkadijalne regulacije na molekularni teret u egzosomima. Uzorci venske krvi za hematološku analizu pomoću hematološkog analizatora bit će uzorkovani u pedijatrijske EDTA epruvete (500 µL), dok će se venska krv za biokemijske analize uzeti u sterilne vakuumske epruvete bez prisutnosti antikoagulansa. Krv za biokemijsku analizu centrifugirati će se nakon 30 minuta na 3500 × g tijekom 10 minuta na 4 °C. Nakon centrifugiranja, učinit će se standardni biokemijski profil pacijenta. Pseći troponin I (cTnI) i natriuretski peptid (NT-proBNP) mjerit će se korištenjem komercijalno dostupnih fluorescentnih imunotestova za kvantitativno mjerenje koncentracija cTnI i NT-proBNP u psećem serumu. Istraživanje će biti provedeno u skladu s institucionalnim smjernicama i Helsinškom deklaracijom. Pisanu suglasnost za provođenje istraživanja na ostatnim uzorcima urina biti će zatražena od svih vlasnika pasa sa dijagnosticiranim MMVD.

Izolacija i karakterizacija egzosoma (˂ 160 nm) – Egzosomi će biti izolirani iz urina (alikvoti 4 x 2 ml) metodom ultracentrifugiranja kako je opisano ranije (Street i sur. 2017). Ukratko, odmrznuti urin biti će prenijet u epruvetu za ultracentrifugiranje i podvrgnut ultracentrifugiranju velikom brzinom (200.000 x g tijekom najmanje 60 minuta na 4°C). Nakon toga, egzosomi će se resuspendirati u PBS i deponirati na -80°C do daljnjih analiza. Suspenzija izoliranih egzosoma u PBS-u biti će podijeljena na manje volumene od 100 µL za korak karakterizacije putem analize praćenja čestica (NTA) (90 µL), transmisijskog elektronskog mikroskopa (TEM) (10 µL)  i Western blot analize (25 µg proteina po uzorku). Preostala suspenzija egzosoma  bit će pohranjena na -80 °C radi moguće daljnje karakterizacije i analize spektrometrijom masa. Karakterizacija izoliranih egzosoma će procijeniti kvalitetu izolacije egzosoma, osiguravajući da su izolirani egzosoma slobodni od kontaminanata i artefakata (kontrola kvalitete) i pružiti daljnje informacije o izoliranim egzosomima (veličina, oblik, morfologija, koncentracija). Za NTA, egzosomi izolirani ultracentrifugiranjem bit će razrijeđeni u PBS otopini kako bi se postigla optimalna koncentracija čestica za analizu (približno omjer 1:100). Za validaciju performansi NTA instrumenta i osiguranje točnosti i pouzdanosti mjerenja, analizirat će se standardi polistirenskih lateksa (kontrolni uzorak). Pet analiza bit će provedeno po uzorku, a srednja distribucija veličine i koncentracije čestica u uzorku bit će izračunate u NTA programu. TEM će se koristiti za procjenu veličine i morfologije egzosoma kao i čistoće uzoraka. Za TEM, egzosomi će biti fiksirani na mikroskopskom stakalcu, obojeni teškim metalima radi poboljšanja kontrasta i snimani pomoću elektronskog mikroskopa. Western blot analiza egzosoma uključuje liziranje egzosoma radi oslobađanja njihovog proteinskog sadržaja, nakon čega slijedi separacija proteina na temelju veličine, korištenjem gel elektroforeze. Proteini se potom prenose na membranu, gdje se pretražuju specifičnim protutijelima usmjerenima na specifične proteine vezikula poput tetraspanina (npr. CD9, CD63 i CD81). Otkrivanje ovih proteina na Western blot membrani ukazuje na prisutnost egzosoma i pomaže potvrditi njihov identitet. Ti rezultati dodatno će potvrditi uspješnost izolacije. U skladu sa smjernicama Međunarodnog društva za izvanstanične vezikule, uromodulin i albumin koristit će se kao negativna kontrola u Western blotu (Lötvall et al. 2014).

Drugi radni paket (druga godina projekta) Voditelj: Josipa Kuleš

Priprema egzosoma iz urina za profiliranje metabolita pomoću neciljane LC-MS/MS metabolomike. Obuhvaća neciljanu metabolomiku uzoraka urina pasa s postavljenom dijagnozom MMVD. U okviru radnog paketa prvo će se provesti testiranje metode na malom broju uzoraka (egzosomi iz urin 4 psa s MMVD i 4 zdrava psa), a zatim neciljana analiza egzosoma iz urina svih pacijenata s MMVD i zdravih pasa primjenom UHPLC-MS/MS spektrometra masa. Rezultati metabolomske analize biti će statistički i bioinformatički obrađeni. Analiza metabolita ekstrahirana iz egzosoma izoliranih iz urina pasa provest će se ciljanim i neciljanim metabolomskim pristupom. Za oba pristupa, uzorci egzosoma bit će lizirani kako je opisano za eksperimente proteomike, a polarni metaboliti i lipidne frakcije biti će analizirane. Neciljani pristup metabolomike provest će se kako je opisano ranije (Thomas i sur., 2016). Za neciljanu analizu, uzorci urina biti će normalizirani prema osmolalnosti prije ekstrakcije. Ukratko, kontrolni uzorak bit će pripremljen miješanjem 10 µL svakog uzorka. Uzorak matrice bit će sastavljen samo od ekstrakcijskih otapala. Za neciljanu frakciju metabolita, 25 µL svakog lizata egzosoma  podvrgnut će se kloroform/metanol/voda (1:3:1, v/v/v) ekstrakciji uz vorteks miješanje (5 min na 4 °C). Svi tipovi uzoraka (kontrolni, matrica i ekstrakti metabolita iz egzosoma) centrifugirat će se (13,000× g 5 min na 4 °C). Supernatant će se pohraniti na −80 °C do analize UHPLC-MS/MS. Ekstrakti metabolita razdvojit će se na 4.6 mm × 150 mm ZIC-pHILIC kromatografskoj koloni (Merck SeQuant, Njemačka) koristeći Dionex UltiMate 3000 RSLC UHPLC (Thermo Fisher Scientific) sustav spregnut s Thermo Orbitrap Q Exactive Plus spektrometrom masa (MS). MS će prikupljat podatke naizmjenično u pozitivnom i negativnom načinu rada, sa elektrosprej ionizacijom na rezoluciji od 70,000 i punim rasponom skeniranja m/z od 70–1050. Mješavina standarada od 148 referentnih spojeva bit će korištena za identifikaciju metabolita. Svaki uzorak biti će analiziran u triplikatu. Metabolomički podaci bit će pohranjeni u EMBL-EBI MetaboLights bazu podataka. Sirovi podaci bit će analizirani programom Compound Discoverer.

Statistička i bioinformatička obrada rezultata. Neciljana metabolomska analiza:

LC-MS podaci bit će analizirani pomoću PiMP platforme razvijene u Glasgow Polyomics laboratoriju (http://polyomics.mvls.gla.ac.uk), koristeći zadane protokole. RAW datoteke konvertirat će se u mzXML format pomoću MSconvert (Holman et al., 2014), a zatim uvesti u PiMP. Identifikacija metabolita provest će se usporedbom mase i vremena zadržavanja s autentičnim standardima i bazama podataka. Spojevi će se dodatno uspoređivati s bazama kao što su Human Metabolome Database (HMDB) i KEGG). Za statističku analizu koristit će se softveri MetaboAnalyst i Compound Discoverer, uz primjenu t-testa (za dvije skupine) i ANOVA-e (za više skupina), uz FDR korekciju (p < 0,05).

Treći  radni paket (treća godina projekta) Voditelj: Josipa Kuleš

Priprema egzosoma za profiliranje proteina TMT metodom obilježavanja proteina i LC-MS/MS  proteomike. Obuhvaća proteomska istraživanja urina pasa s dijagnosticiranim MMVD i zdravih pasa primjenom kvantitativne proteomike metodom obilježavanja s TMT. Nakon testiranja metode na malom broju uzoraka, svi uzorci egzosoma iz urina pacijenata biti će analizirani na nanoLC-MS/MS spektrometru masa (dvije tehničke replike). Rezultati će biti statistički i bioinformatički obrađeni, te nakon toga proteini (biomarkeri) od interesa validirani na novim uzorcima s dijagnozom MMVD. Analiza proteina izoliranih iz egzosoma urina pasa provest će se primjenom kvantitativne TMT metode obilježavanja proteina, kako je opisano ranije (Bilić i sur. 2023). Ukratko, kako bi se pročistili i koncentrirali proteini, odmrznuti uzorci urina pojedinačno će biti obrađeni ultrafiltracijom korištenjem centrifugalnih filtera Amicon® Ultra (Merck, Darmstadt, Njemačka) s granicom molekularne težine od 10 kDa. Pojedinačni uzorci urina dodani su u uređaj, centrifugirani pri 5500 × g tijekom 10 minuta na 4 ◦C i isprani dva puta s 1 mL ultračiste vode pod istim uvjetima. Zatim je dodan 1 mL 100 mM trietilamonijevog bikarbonatnog pufera (TEAB) (Sigma Aldrich, St. Louis, SAD), kompatibilan s daljnjom proteomskom analizom, a uzorci su ponovno centrifugirani pri 5500 × g tijekom 10 minuta na 4 °C. Konačno, ultrafiltrat je sakupljen obrnutim centrifugiranjem pri 1000 × g tijekom 3 minute na 4 °C. Koncentracija proteina u ultrafiltriranim uzorcima urina biti će određena kolorimetrijskom metodom korištenjem komercijalnog reagensa za proteine ​​urina/cerebrospinalne tekućine (Beckman Coulter, CA, SAD) prema uputama proizvođača na automatiziranom kemijskom analizatoru.  TMT reagensi (Thermo Scientific, Rockford, USA) koristit će se za multipleks identifikaciju i kvantifikaciju proteina tandemskom spektrometrijom masa (MS/MS). Uzorci proteina urina označeni su na isti način korištenjem TMT reagensa prema uputama proizvođača. Maksimalno 35 µg proteina razrijedit će se do volumena od 100 µL pomoću 0.1 M TEAB pufera. Interni standard pripremit će se miješanjem jednakih količina proteina svakog uzorka. Dobiveni proteinski peleti digestirati će se pomoću tripsina. TMT reagensi pripremit će se prema protokolu proizvođača. Pet TMT-modificiranih uzoraka peptida kombinirat će se s internim standardom (pul) u novu epruvetu, podijeliti na manje volumene, osušiti i pohraniti na −80 °C za naknadnu LC-MS/MS analizu. LC-MS/MS analiza provest će se korištenjem Ultimate 3000 RSLCnano sustava tekućinske kromatografije (Dionex, Njemačka) spregnutim s Q Exactive Plus spektrometrom masa  kako je objašnjeno (Horvatić i sur., 2019). Diferencijalno TMT-označeni peptidi ukoncentrirat će se na kromatografskoj predkoloni i razdvojiti na analitičkoj koloni (PepMap™ RSLC C18, 50 cm × 75 μm, Thermo Scientific, USA). MS će se raditi u pozitivnom ionizacijskom modu. MS skeniranja provest će se u rasponu od m/z 350.0 do m/z 1800.0 sa rezolucijom od 70,000.  Svaki ,,six-plex” biti će analiziran u triplikatu. Sirovi proteomski podaci bit će pohranjeni u ProteomeXchange Consortium putem PRIDE partnerskog repozitorija i analizirani u Proteome Discovereru.

Statistička i bioinformatička obrada rezultata. Proteomska analiza: Identifikacija i kvantifikacija proteina provest će se korištenjem Proteome Discoverer (v2.3, Thermo Fisher Scientific) sa SEQUEST algoritmom za analizu neobrađenih MS i MS/MS spektara. Baza podataka Uniprot (Canis lupus familiaris) pretraživat će se s parametrima: dva promašena mjesta cijepanja tripsina, tolerancija mase prekursora i fragmenta 10 ppm / 0,02 Da, fiksna modifikacija karbamidometil (C), te dinamičke modifikacije oksidacija (M) i TMT sixplex (K, N-terminus peptida). Stopa lažnog otkrivanja (FDR) za peptide određivat će se pomoću Percolator algoritma, s granicom od 1 %. Proteini s najmanje dva jedinstvena peptida i FDR ≤1 % bit će smatrani pouzdano identificiranima. Kvantifikacija će biti normalizirana: između šest-plex smjesa pomoću internog standarda, a unutar svake smjese prema ukupnoj količini peptida. Podaci će biti pohranjeni u ProteomeXchange preko PRIDE repozitorija. Proteini s više od 50 % nedostajućih vrijednosti (po uzorku i skupini) bit će isključeni iz statistike. Statistička analiza provodit će se u R (v3.2.2), a outlieri će se detektirati Dixonovim testom (R paket outliers v0.14). Pouzdano kvantificirani Canis lupus proteini analizirat će se pomoću FunRich (v3.1.3), uz daljnju analizu putem Vesiclopedia. Potvrđeni egzosomalni proteini bit će obrađeni u StringApp (Cytoscape v3.10.1) za izgradnju mreža i funkcionalno obogaćivanje (String baza). PANTHER (v17.0) će se koristit za dodatnu funkcionalnu klasifikaciju, s odabranim referentnim organizmom Homo sapiens. Za analizu numeričkih podataka koristit će se MedCalc v12.5.0.0. Budući da se očekuje odstupanje od normalne distribucije (Shapiro-Wilkov test), za usporedbu više od dvije skupine primijenit će se Kruskal-Wallisov test, a za dvije skupine Mann-Whitneyev test. Proteini s FDR-prilagođenom p-vrijednošću < 0,05 smatrat će se značajnima. Promjene ekspresije izražavat će se kao log2 omjeri između skupina. Izradit će se analiza glavnih komponenti (PCA) i vulkanski grafikoni pomoću R paketa ggplot2 v3.1.173.

Četvrti radni paket (četvrta godina projekta) Voditelj: Vladimir Mrljak

Priprema egzosoma iz urina za profiliranje metabolita pomoću ciljane LC-MS/MS metabolomike.  Četvrti radni paket obuhvaća ciljanu metabolomiku primjenom laboratorijskog kita tvrtke BIOCRATES, Austrija (Absolute IDQ p400) za primjenu na našem Q EXACTIVE PLUS spektrometru masa. U okviru kita posebnom procedurom analizira se prisutnost 408 metabolita iz 11 klasa u uzorcima egzosoma iz urina pasa s MMVD i zdravih pasa (kvantitativna analiza). Ciljanom metabolomikom bit će provedena analiza liziranih egzosoma korištenjem Absolute IDQ p400 kompleta. Ovaj komplet omogućuje detekciju i kvantifikaciju metabolita kombinirajući tekućinsku kromatografiju i spektrometriju masa (LC-MS/MS) i analizu injektiranjem u protok uz detekciju na spektrometru masa (FIA-MS/MS). LC-MS/MS analiza kvantificira bjelančevine i biogene amine, dok će se FIA-MS/MS koristiti za kvantificiranje acilcarnitina, glicerofosfolipida, glicerida, heksoza, kolesterolnih estera i sfingolipida. Pripreme uzoraka za ciljanu metabolomičku analizu provest će se prema protokolima proizvođača koji dolaze s kompletom. Ukratko, ekstrakti metabolita bit će pripremljeni na specifičnoj pločici s 96 pozicija, u tri koraka što uključuje uklanjanje proteina, normalizaciju unutarnjih standarda i derivatizaciju. Ukratko, po 10 μL lizata egzosoma, standarda kalibracije, nultog standarda (fosfatno-puferirana sol) i uzorci za kontrolu kvalitete (QC 1–3) bit će pojedinačno dodani na sredinu filtra na pločici. Pločica će zatim biti osušena, a metaboliti derivatizirani. Na kraju, derivatizirani metaboliti bit će prikupljeni s pločice pomoću vakuum filtracije i analizirani pomoću UHPLC-MS/MS instrumenta (Thermo Scientific). MS analiza bit će izvedena u pozitivnom i negativnom ionizacijskom načinu rada za LC-MS/MS i FIA-MS/MS, s prikupljanjem podataka u punom skeniranju. Prikupljeni MS podaci će biti obrađeni pomoću WebIDQ softvera (Biocrates, Life Science AG) prije statističke analize. Konačne koncentracije metabolita bit će kvantificirane koristeći kalibracijske krivulje i kalibraciju s jednom točkom.

Statistička i bioinformatička obrada rezultata. Ciljana metabolomska analiza: Rezultati će se analizirati u MetIDQ softveru prema uputama proizvođača (Biocrates Life Science). Kvantifikacija LC-MS analita provodit će se u XCalibur Quan 4.1 temeljem kalibracijske krivulje (sedam točaka) i izotopski označenih unutarnjih standarda. FIA-MS kvantifikacija koristit će jednu kalibracijsku točku. Značajni metaboliti iz ciljanog i neciljanog pristupa bit će analizirani u MetaboAnalyst radi mapiranja metaboličkih puteva pomoću hipergeometrijskog testa i baze Homo sapiens.

Peti radni paket(tijekom druge polovice četvrte godine projekta) Voditelj: Vladimir Mrljak

Integracija i diseminacija rezultata istraživanja. Peti radni paket objedinjuje aktivnosti diseminacije rezultata istraživanja iz 4 prethodna radna paketa. Istovremeno – objedinit će se proteomska i metabolomska istraživanja i primijenit integrirani pristup (integromics). Statistički značajno promijenjeni i identificirani proteini i metaboliti, povezani s jedinstvenim genima, povezat će se kako bi se izgradio klasifikacijski model u kojemu će jedinstveni proteini i metaboliti razlikovati eksperimentalne grupe (psi iz B1 skupine u odnosu na B2 skupinu, u odnosu na C skupinu, odnosno u odnosu na zdrave pse). Peti radi paket obuhvaća i sudjelovanje na kongresima kao i publiciranje najmanje tri rada u Q1 prema SCOPUS, odnosno WoS.

Povezivanje statističkih i bioinformatičkih Omics podataka. Integrirani omics pristup (integromika): Radi dubljeg uvida u biološke procese povezane s MMVD, provest će se integracija značajno promijenjenih i identificiranih proteina i metabolita povezanih s genima. Rezultat će biti klasifikacijski model koji diferencira bolesne i zdrave pse, čime se nadilaze ograničenja pojedinačnih omics pristupa. Biološki putevi obradit će se u MetaboAnalystu s parametrima za Homo sapiens.

Validacija egzosomalnih proteina (Western blot i/ili ELISA): Na temelju spektrometrijskih rezultata, odabrat će se pet značajnih proteina relevantnih za rane stadije MMVD (B1 i B2). Izolirani egzosomski proteini iz urina analizirat će se metodama Western blot i/ili ELISA, ovisno o dostupnosti materijala. Western blot uključuje SDS-PAGE (25 µg proteina), prijenos na nitrocelulozne membrane (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad), Ponceau S bojanje, snimanje na Odyssey Fc (Licor), te vizualizaciju kemiluminiscencijom. Obrada slika provest će se u ImageJ, uz normalizaciju na ukupnu količinu proteina. Količina pojedinih proteina će biti izraženi kao srednja vrijednost ± SD (N=3), a značajnost razlika u ekspresiji procijenit će se pomoću ANOVA ili Kruskal-Wallis testa (p < 0,05). Time će se potvrditi nalazi iz MS analize i pridonijeti razumijevanju rane patogeneze MMVD.

Očekivani rizik – Tijekom provedbe projekta mogu se pojaviti različiti rizici koji mogu utjecati na njegov napredak. Sukladno tome, predviđene su mjere za različite scenarije, a sve usmjerene na postizanje ciljeva projekta ‘’EGZODOG’’- To uključuje: a) Promjene u radnom timu (niski rizik) – Održavanje redovite komunikacije i rasprava između članova tima; b) Kašnjenje u izvješćima (niski rizik) – kontinuirano praćenje aktivnosti uz učinkovitu raspodjelu posla od strane voditelja projekta; c) Kliničko osoblje nije u mogućnosti prikupiti sve uzorke od pasa s MMVD (niski rizik) – Osiguravanje redovite komunikacije i razgovora između članova tima i svih članova Sveučilišne veterinarske bolnice VEFUNIZG. Tijekom 2024. godine u bolnicu je primljeno više od 220 bolesnika s MMVD, odnosno 96 bolesnika s B1 i B2 stadijem. U hitnim slučajevima predviđen je kontakt s velikim klinikama u Zagrebu. d) Kašnjenje u postavljanju osnovnih laboratorijskih metoda i alata potrebnih za potpunu provedbu predloženih aktivnosti (srednji do niski rizik) – učinkovito planiranje svakog koraka, počevši od nabave potrebne opreme i potrošnog materijala; e) Kašnjenja u isporuci potrebnih reagensa, sondi i potrošnog materijala (mali do srednji rizik) – pravovremeno pokretanje kompliciranog postupka javne nabave i potpisivanje čvrstih ugovora; f) Tehničke poteškoće sa softverom (srednji rizik) – redovite provjere održavanja i protokoli za rješavanje problema, kao i opcija alternativnog softvera; g) Gubitak ključnog osoblja zbog nepredviđenih okolnosti (srednji rizik) – Razvoj planova za nepredviđene situacije, unakrsna obuka članova tima i održavanje jasnog plana sukcesije kako bi se poremećaji sveli na minimum;

 

  4. očekivani doprinos razvoju istraživanja na Sveučilištu u Zagreb, Veterinarski fakultet

    Provedbom predloženih projektnih aktivnosti unaprijedit će se istraživačko-razvojni i inovacijski    kapaciteti Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Projekt će omogućiti uvođenje novih inovacijskih procesa u području otkrivanja biomarkera za dijagnostiku bolesti, s naglaskom na veterinarsku, ali i opću medicinu. Jedan od ključnih ciljeva projekta je doprinos ranoj dijagnostici degenerativne bolesti zalistaka (MMVD) u pasa, što bi moglo otvoriti i nove pravce istraživanja unutar veterinarske medicine. Usvajanje inovativnih metodologija u identifikaciji biomarkera omogućit će razvoj novih dijagnostičkih alata, uključujući i brzi test za detekciju MMVD, čime bi se postigla primjena „know-how“ znanja u stvarnom okruženju. Novonabavljena inovativna oprema najnovije generacije („state-of-the-art“) dodatno će osnažiti kapacitete Fakulteta. Korištenjem sofisticiranih tehnologija, kao što su spektrometrija masa (npr. nanoLC-MS/MS), Fakultet će moći proširiti svoje istraživačke aktivnosti na nova područja veterinarske medicine te doprinijeti digitalizaciji istraživanja. Dobiveni digitalni rezultati omogućit će pretraživanje relevantnih znanstvenih baza podataka u cilju identifikacije specifičnih proteina ili metabolita. Proteomski podaci generirani tijekom projekta bit će pohranjeni u repozitorij ProteomeXchange Consortium putem PRIDE platforme, dok će metabolomski podaci biti pohranjeni u bazu podataka EMBL-EBI MetaboLights, čime se osigurava transparentnost i dostupnost podataka znanstvenoj zajednici. Očekuje se da će uspješna provedba projekta potaknuti daljnja istraživanja i inicijativu među znanstvenicima, rezultirajući novim projektima i boljim iskorištavanjem opreme. To će izravno doprinijeti dugoročnoj održivosti ulaganja te povećati financijske kapacitete Fakulteta. Nadalje, objava novih istraživačkih rezultata u visoko indeksiranim znanstvenim časopisima dodatno će povećati znanstvenu vidljivost i reputaciju Sveučilišta u Zagrebu na nacionalnoj i međunarodnoj razini.

 

  5. očekivani doprinos području istraživanja i/ili razvoju društva i gospodarstva

Očekujemo da će naš inovativni pristup otkrivanju novih biomarkera za degenerativnu bolest mitralnih zalistaka (MMVD) kod pasa, korištenjem izvanstaničnih vezikula (egzosoma), rezultirati identifikacijom biomarkera specifičnih za ranu fazu bolesti. Primjena takvih biomarkera u kliničkoj praksi omogućila bi raniju dijagnostiku MMVD-a, što je ključno za uspješnije liječenje ove učestale i kronične kardiološke bolesti pasa. Time se izravno doprinosi unaprjeđenju veterinarske kardiologije te dobrobiti životinja. Osim veterinarske primjene, rezultati istraživanja mogu imati translacijski potencijal u humanoj medicini, osobito s obzirom na činjenicu da su kardiovaskularne bolesti jedan od vodećih uzroka smrtnosti kod ljudi. Uspješna validacija egzosomalnih biomarkera kod pasa može otvoriti nova istraživačka vrata u razvoju dijagnostike i terapije srčanih bolesti kod ljudi, potičući međudisciplinarnu suradnju između veterinarske i humane medicine. S aspekta doprinosa društvenom i gospodarskom razvoju, projekt ima potencijal za razvoj novih dijagnostičkih alata, poput brzih testova baziranih na identificiranim biomarkerima, koji bi bili jednostavni za korištenje u veterinarskim ambulantama i na terenu. Takvi testovi bi unaprijedili stručnu praksu, omogućili bržu i precizniju dijagnostiku te smanjili troškove liječenja. Potencijal za komercijalizaciju novih biomarkera i razvoj popratnih dijagnostičkih proizvoda mogao bi rezultirati stvaranjem novih poslovnih prilika za biotehnološke i veterinarske tvrtke. Dugoročno gledano, ovaj projekt može doprinijeti jačanju inovacijskog kapaciteta u području veterinarske biomedicine, povećanju konkurentnosti domaće znanstvene i tehnološke zajednice te stvaranju dodane vrijednosti za gospodarstvo kroz transfer tehnologije i znanja.

 

Potrebna infrastruktura za provedbu projekta

U Laboratoriju za proteomiku nalazi se oprema za proizvodnju imunokromatografskih testova odnosno testova koji se temelje na ,,lateral flow“ tehnologiji tvrtke BioDot (Chichester, UK), a uključuje: ZX1010 (Dispensers 8max) – sustav s mogućnošću do 8-kanalnog ispisivanje linija ili točkica na membranama za dijagnostičke testove; CM5000 – sustav (rezač) za proizvodnju, odnosno rezanje ,,lateral-flow’’ testova. U Laboratoriju je oprema za genomska i proteomska istraživanja, kao što su izolacija DNA, RNA i proteina, uzgoj staničnih kultura, PCR i RT-PCR, proizvodnja rekombinantnih proteina, elektroforeza, te identifikacija i kvantifikacija proteina pomoću LC-MS/MS. Prostori za pripremu uzoraka i uzgoj staničnih kultura opremljeni su sa sigurnosnim kabinetima TopAir 1.2 i Aura mini laminarnim kabinetima (Bioair), CO2 inkubatorom (Memmert), digitalnim inkubatorima (WIG-32, Witeg) i autoklavom potrebnim za osiguranje sterilnih uvjeta i proizvodnju rekombinantnih proteina. Radni prostor opremljen je sonikatorom za lizu stanica te purifikaciju i izolaciju proteina (afinitetna kromatografija, gel filtracija), kao i ostalom opremom za molekularne analize kao što je Nanodrop, uređaj za izoelektrično fokusiranje, SDS-PAGE, vakuum centrifuga, centrifuga s hlađenjem, -80⁰C ledenica s CO2 back up-om, ultrasonični sustavi, itd. U prostoru za rad s nukleinskim kiselinama nalaze se PikoReal Real-Time i Piko-96 well PCR (oba Thermo), te Odyssey FC (LI-COR), uređaj za fotodokumentaciju i slikovnu analizu. U prostoru za spektrometriju masa nalazi se maseni spektrometar nanoLC i UHPLC Q Exactive Plus Orbitrap MS/MS (Thermo Scientific).

 

Održivost rezultata

Rezultati predloženog projekta imat će utjecaj na nekoliko aspekata održivosti projekta. Ostvareni ciljevi predloženog projekta predstavljat će solidan temelj za aplikaciju na nove, kompetitivne projekte, te pružiti dobru osnovu za nastavak aktivnosti. Otkrivanje novih biomarkera rane dijagnostike degenerativnih bolesti zalistka srca pomoći će veterinarima u klinikama u liječenju ove kronične, teške bolesti, te istovremeno značajno pridonijeti dobrobiti pasa. Otkrivanje mehanizama koji leže u pozadini MMVD-a kod pasa omogućit će potencijal za razvoj terapija usmjerenih na sprječavanje ili odgađanje ove bolesti kod ljudi, ali također utjecati na smanjivanje troškova liječenja. Rezultati istraživanja mogli bi utjecati na veću primjenu egzosoma i urina u dijagnostičke i terapijske svrhe kod drugih bolesti.  Očekuje se da će istraživači s VEFUNIZG još više primijenjivati nove, inovativne tehnologije (proteomiku i metabolomiku) u svojim istraživanjima, odnosno projektima. Rezultati projekta utjecat će na čimbenike institucionalne održivost, jer će istraživači biti u mogućnosti prijaviti bolje projekte što će rezultirati većim financijskim sredstvima potrebnim za održavanje skupe, inovativne opreme u Laboratoriju za proteomiku VEFUNIZG. Novi projekti dovest će do bolje iskoristivosti opreme, a time smanjiti troškove i fakultetu. Primjena nove, inovativne tehnologije omogućit će znanstvenicima s VEFUNIZG da prijavljuju nove kompetitivne, međunarodne projekte, da se uključuju u međunarodne kolaborativne projekte kao partneri, što će dodatno povećati vidljivost Veterinarskog fakulteta. Otkrivanje novog biomarkera za ranu dijagnostiku MMVDa moglo bi otvoriti perspektivu za zaštitu intelektualnog vlasništva. Novi dijagnostički biomarkeri rezultati utjecat će na bolju vidljivost Fakulteta kroz bolje publikacije u časopisima s većim čimbenikom odjeka. Predviđa se objavljivanje tri rada u časopisima s visokim čimbenikom odjeka. Rana dijagnostika MMVDa s novim biomarkerom utjecat će i na popularizaciju rezultata istraživanja u kinološkim krugovima.

 

Istraživački tim/suradnici na projektu

Istraživački tim projekta EGZODOG čine:

Djelatnici Klinika za unutarnje bolesti. Profesor Vladimir Mrljak, voditelj projekta EGZODOG, odgovoran je za sve aktivnosti unutar Projekta, odnosno prikupljanje uzoraka urina i krvi u ambulantama, pripremu uzoraka urina za izolaciju i karakterizaciju egzosoma, pripremu uzoraka egzosoma iz urina za proteomsko i metabolomsko istraživanje, interpretaciju proteomskih i metabolomskih rezultata.

Djelatnici iz Klinike za unutarnje bolesti prikupljat će uzorke mokraće i krvi (seruma i pune krvi) u ambulantama malih životinja kako bi se otkrili novi biomarkeri za ranu dijagnostiku bolesti srca u pasa. Svi psi sa sumnjom na bolesti srca biti će pregledani u specijaliziranim ambulantama za kardiološke bolesti malih životinja.

Profesor Marin Torti posjeduje bogato iskustvo u problematici kardioloških bolesti malih životinja i educiran je iz područja veterinarske kardiologije u sklopu specijalizacije Američkog koledža veterinarske interne medicine. Odgovoran je za klinički pregled pasa, te postavljanje i stupnjevanje MMVD, otkrivanje poremećaja srčanog ritma, kao i  za interpretaciju proteomskih i metabolomskih rezultata. Viša asistentica dr. sc. Ines Jović doktorirala na ultrazvučnim pokazateljima promjena na srcu pasa i ima bogato iskustvo u dijagnostici i liječenju bolesti srca malih životinja. Doktorica Jović biti će odgovorna za klinički pregled pasa sumnjivih na MMVD, i za ultrazvučnu dijagnostiku MMVD. Asistentica Katarina Marjanović, dr.vet.med. biti će odgovorna za klinički pregled pasa sumnjivih na MMVD te za pripremu uzoraka za hematološku i biokemijsku analizu, te analizu urina. Profesorica Martina Crnogaj ima veliko iskustvo u dijagnostici unutarnjih bolesti, odnosno kardioloških bolesti. Biti će odgovorna za pregled pasa sumnjivih na MMVD, za interpretaciju hematoloških, biokemijskih nalaza krvi pacijenata i zdravih pasa, te nalaza urina, za tumačenje proteomskih i metabolomskih rezultata. Profesor Damjan Gračner ima veliko iskustvo u dijagnostici unutarnjih bolesti. Biti će odgovoran za pregled pasa sumnjivih na MMVD, za tumačenje proteomskih i metabolomskih rezultata. Dr. sc. Dina Rešetar Maslov (dr. sc. Rešetar Maslov od lipnja 2025. godine više ne radi na Veterinarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu), ima veliko iskustvo u proteomski i metabolomskim istraživanjima, odnosno u izolaciji i identifikaciji izvanstaničnih vezikula (egzosoma). Doktorica Rešetar Maslov biti će zadužena za pripremu uzoraka za izolaciju i identifikaciju izvanstaničnih vezikula, za izolaciju izvanstaničnih vezikula ultracentrifugiranjem, za NTA i TEM validaciju, Western Blot analizu, pripremu uzoraka za proteomsku i metabolomsku analizu.

Djelatnici Zavoda za kemiju i biokemiju. Profesorica Renata Barić Rafaj ima veliko iskustvo u analizi laboratorijkih rezultata povezano s dijagnostikom unutarnjih bolesti te u analizi proteomskih i metabolomskih istraživanja. Biti će zadužena za pripremu uzoraka za izolaciju i identifikaciju egzosoma, za Western Blot analizu, za pripremu uzoraka za proteomska i metabolomska istraživanja, za interpretaciju proteomskih i metabolomskih nalaza. Docentica Josipa Kuleš ima veliko iskustvo u analizi proteomskih i metabolomskih istraživanja. Biti će zadužena za pripremu uzoraka za izolaciju egzosoma ultracentrifugiranjem, za NTA i TEM validaciju, pripremu uzoraka za proteomsku i metabolomsku analizu i za bioinformatičke analize proteomskih i metabolomskih istraživanja.

Djelatnica Zavoda za higijenu, ponašanje i dobrobit životinja. Profesorica Gordana Gregurić Gračner ima veliko iskustvo u području dobrobiti životinja. Biti će odgovorna za etičku prihvatljivost istraživanja koja će se provoditi na psima kod kojih će biti postavljena sumnja na kardiološke bolesti.

Djelatnik Sveučilišta u Mursiji, Španjolska. Profesor Jose Ceron ima bogato iskustvo u istraživanju biomarkera u veterinarskoj medicini kao i u kliničkoj primjeni određenog biomarkera u laboratoriju. Profesor Ceron ima iskusto u patentiranju biomarkera u veterinarskoj medicini. Dugogodišnja suradnja s istraživačkom grupom profesora Jose Cerona sa Sveučilišta u Murciji, Španjolska rezultirala je time da će uzorci urina zdravih pasa koji su došli na kastraciju na  Veterinarski fakultet Sveučilište u Mursiji, biti dostavljeni u Laboratorij za proteomiku VEFUNIZG u Zagrebu. Članovi Laboratorija za proteomiku VEFUNIZG sudjelovat će u istraživanju na način da će sva laboratorijska istraživanja biti provedena u Laboratoriju za proteomiku. U Laboratoriju će se provesti proteomska i metabolomska analiza egzosoma iz urina pasa s degenerativnom bolesti mitralnih zalistaka kao i validacija odabranih proteina.

 

Financiranje projekta

Financira Europska unija – NextGenerationEU

Ovaj projekt financira se u okviru Nacionalnog plana oporavka i otpornosti (NPOO) prema Pozivu Fakulteta za financiranje institucionalnih istraživačkih projekata koji se financira iz izvora 581 – Mehanizam za oporavak i otpornost.

 

 

Trajanje projekta

  1. 12. 2025. – 17. 12. 2029.

Voditelj projekta: Prof. dr. sc. Vladimir Mrljak, Professor emeritus

Vrijednost projekta: 100.000 EUR

Kontakt:

Prof. dr. sc. Vladimir Mrljak, Professor emeritus

Sveučilište u Zagrebu

Veterinarski fakultet

Klinika za unutarnje bolesti

Heinzelova 55

10000 Zagreb

Tel: 2390 346

       2390 329

E-mail: vmrljak@vef.hr